Indicações para o teste:

• Rearranjos em tumores epiteliais e de partes moles.
• Preditivo de resposta à terapia: Câncer de pulmão não de pequenas células em estágio avançado (pode ser responsivo ao inibidor de ALK crizotinib).
• Resistência à terapia com inibidores tirosina kinase anti-EGFR (erlotinib).
• Diagnóstico: Tumor miofibroblástico inflamatório.

Procedimento e interpretação do teste:

O tecido fixado em formalina e embebido em parafina em uma lâmina de vidro é desparafinizado e depois tratado com pepsina para digerir as proteínas do tecido e permitir que as sondas atinjam o DNA alvo. O DNA é então desnaturado pelo calor e subsequentemente permitido hibridizar com o conjunto de sondas específicas.

Após a hibridização, as lâminas são lavadas para remover qualquer excesso de sondas não ligadas e os núcleos são corados com a coloração DAPI (4',6'-diamino-2-fenil-indol).

A enumeração dos sinais de quebra/separação é realizada por exame microscópico dos núcleos das células, usando um microscópio de fluorescência e equipado com filtros de emissão e excitação apropriados.

Os resultados são obtidos após análise de um mínimo de 50 núcleos interfásicos (100 no total) com os resultados expressos como a porcentagem de núcleos anormais.

Relevância clínica:

O gene ALK codifica um receptor de membrana de tirosina quinase, e em humanos está localizado no cromossomo 2p23.

A expressão anormal da proteína e aberrações do gene ALK foram descritas em tecido não hematopoiético normal, em alguns linfomas B raros e em certos tumores de tecidos moles, como o tumor miofibroblástico inflamatório.

FISH usando sondas de separação (em inglês, break-apart) é a tecnologia mais amplamente utilizada para detecção de rearranjos de genes ALK na prática da patologia molecular.

Atualmente o iNova Molecular, usa um kit de sondas ALK break apart FISH como ferramenta de diagnóstico complementar para elegibilidade de tratamento à base de crizotinibe e outros inibidores de ALK.

Resultados e considerações:

Duas sondas diferentes e marcadas que hibridizam em um ponto de ruptura do gene ALK.

O resultado positivo de FISH ALK é estabelecido usando um limiar de 15% de células tumorais mostrando sinais separados por pelo menos 2 diâmetros de sonda ou sinais vermelhos isolados 3' (devido à deleção da sonda 5'). Quando o gene ALK se rompe e ocorre a translocação subsequente (esta sonda não identifica parceiro de translocação específico), por isso identifica-se um sinal laranja, um verde e um amarelo.

Padrão de sinal vermelho 3' isolado e outros padrões de sinal atípico (sinais verdes 5' ou duplo vermelho) podem resultar em resultados falsos positivos e negativos quando comparados com a detecção por sequenciamento de próxima geração.

Polissomia incluindo aumento do número de cópias ou amplificação detectada por FISH não prediz a resposta à terapia com inibidores de ALK direcionados.

Problemas associados a imunofenótipo e FISH discordantes ou FISH falso negativo incluem deleções/rearranjos complexos, inserções crípticas, alterações do promotor ALK e amplificação gênica.

O resultado negativo acontece na presença de dois sinais amarelos de fusão por núcleo e representam um achado normal.

Os resultados devem ser interpretados no contexto dos achados clínicos, história familiar e outros dados laboratoriais. A interpretação incorreta dos resultados pode ocorrer se as informações fornecidas forem imprecisas ou incompletas.

Referências:

1. Kutok JL, Aster JC. Molecular biology of anaplastic lymphoma kinase-positive anaplastic large-cell lymphoma. J Clin Oncol. 2002 Sep 1;20(17):3691-702. Review.
2. Morris SW, Kirstein MN, Valentine MB, et al: Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin 's lymphoma. Science. 1994 Mar 4;263(5151):1281-4. Erratum in: Science. 1995 Jan 20;267(5196):316-7.
3. https://issuu.com/iaslc/docs/alk-ros1_atlas_low-res/52
4. https://www.cap.org/protocols-and-guidelines/cancer-reporting-tools/cancer-protocol-templates
5. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29355391/